陈玲玲教授和杨力教授的最新力作：病毒感染相关因子调控circRNA形成

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声 明

        6月15日，Cell子刊Molecular Cell杂志同步在线发表了两篇circRNA的研究论文，其中一篇为陈玲玲教授和杨力教授作为共同通讯作者的文章。下面我们先一起来详细学习一下他们的这一新作：

        本文主要报道发现了病毒感染相关的因子NF90/NF110参与circRNA的形成过程。是通过RNA干扰文库筛选鉴定出来的，NF90/NF110通过稳定内含子互补序列结构促进circRNA的形成。病毒感染的条件下，诱导NF90/NF110出核并抑制病毒复制，circRNA生成量也随之降低[1]。

NF90/NF110是如何发现的？

        目前关于circRNA的形成机制的报道不是特别多，内含子的反向互补序列与circRNA的形成有重要的对应关系，但究竟是什么因子介导了这一过程，目前还没有形成系统的共识。基于这一状态，作者设计了一套报告系统，用于筛选与circRNA形成有关的因子，其中便发现了NF90/NF110。

        在该报告系统中，作者构建了Dox诱导表达的含IRES的反向拼接报告系统，如果实现了正确的RNA拼接过程，中间部分会因为反向互补的内含子序列而被环化，形成完整的mCherry荧光蛋白，可检测到红光，其余的RNA正确拼接后会形成GFP蛋白。而如果仅仅是常规的拼接活动，没有中间的环化过程，则会因为GFP中间插入了核酸序列而无法形成正确的荧光蛋白。该系统可基于荧光检测实现高通量快速筛选目标蛋白。作者在该系统中基于全基因的RNA感染文库（ON-TARGETplus）筛选与circRNA形成有关的因子。

图1 circRNA形成因子筛选报告系统（来自[1]）

        基于该报告系统的高通量RNAi筛选分析，作者共鉴定到787个基因干扰后导致mCherry的信号强度减少1.5倍以上，其中103个为RNA结合蛋白，其中30种参与了RNA剪切调控作用，16种与免疫效应通路有关，11种具有核酸螺旋酶功能，7种具有核酸酶功能。利用GFP进行归一化（Normalization），进一步通过shRNA验证后表明，这些蛋白大部分会影响circRNA的形成过程。令人诧异的是，一些免疫信号的分子也影响了circRNA的形成！其中包括来源于ILF3基因的NF90/NF110。

图2 高通量筛选影响circRNA形成的因子（来自[1]）

NF90/NF110在基因组层面影响circRNA形成

        基于RNA Pull-down实验，ADAR1和NF90可牢固结合双链RNA，但不能结合单链RNA。ADAR1已报道是抑制circRNA的形成过程的。NF90/NF110也报道可以结合双链RNA。NF110还可以结合单链Alu元件RNA序列。

图3 NF90/NF110结合RNA序列特性分析（来自[1]）

        作者通过分别构建稳定敲低NF90和NF110的细胞株，分析这些细胞中Poly(A)+的mRNA及Poly(A)- /Ribo–的RNA转录组状况，发现当敲低NF90或NF110之后，细胞中circRNA的表达状态有很大的改变，两种敲低细胞系中有85%的是共同表达的，其中50%发生了表达下降。而所有明显下降的circRNA中70%是可以同时在两种敲降的细胞系中检测到的，这说明NF90和NF110是靶向共同的基因的，这也得到了随机挑选的circRNA实验的验证。测序检测到的只是收集样品的那一刻的表达状态，其差异一方面可能是降解速度差异造成的，另一方面可能是新生成速率差异造成的。基于掺入法检测新生成RNA分子，NF90和NF110敲降后的确降低了新生成circRNA的量，而过表达Flag标记的NF90和NF110则可提高新生成circRNA的含量比例。NF90和NF110双敲低的稳定株无法获得，会导致细胞死亡。

图4 敲低NF90和NF110后影响circRNA表达状态（来自[1]）

NF90/NF110通过稳定内含子互补形成的双链结构初级circRNA形成

        基于Nascent RIP（脉冲标记4sU标记新生RNA分子，然后基于Flag标签抗体纯化NF90/NF110进行RIP后分离新生RNA分子），作者发现NF90/NF110结合RNA序列绝大部分位于内含子区。iCLIP实验表明NF90/NF110更倾向于结合富含AU的序列。NF90更倾向于结合能形成circRNA的内含子区的Alu序列上。

图5 NF90通过结合反向互补RNA元件促进circRNA生成（来自[1]）

        基于上述结果，作者认为NF90是通过结合并稳定反向互补RNA序列促进circRNA形成的，尤其是富含AU的反向互补序列（例如Alu元件）。于是作者进一步构建了NF90的不同截短型，分别分析了对circRNA生成的影响，这些突变型对富含AU的反向互补序列影响较明显，而对于circRBM33（反向互补的内含子不含有富AU元件）在不会受到太明显的影响。

图6 NF90通过结合富含AU的反向互补RNA元件促进circRNA生成（来自[1]）

Poly(I:C)处理后NF90/NF110转移至胞质并导致circRNA表达降低

        当细胞遇到感染物质（比如病毒）刺激后，NF90/NF110会由细胞核转移至细胞质中，并结合病毒因子，抑制其复制。当细胞经Poly(I:C)处理后，NF90/NF110会明显的出核。Nascent RIP实验也表明NF90/NF110结合的RNA量会有所下降，进而导致circRNA表达下降。Poly(I:C)处理后下降的circRNA与NF90/NF110敲降后的高度吻合。在Poly(I:C)处理条件下如果过表达NF90则可逆转Poly(I:C)处理的作用。

图7 Poly(I:C)诱导NF90/NF110出核并降低circRNA表达（来自[1]）

病毒感染后NF90/NF110从circRNP复合物中剥离，转而结合病毒因子

        NF90/NF110结合双链RNA的特性与序列的相关性不强，因此作者认为NF90/NF110很可能也会直接结合circRNA。通过RIP实验证实了这一假设。

图8 NF90/NF110可直接结合circRNA（来自[1]）

        体外RNA Pull-down实验也发现在序列一致的前提下，NF90/NF110更倾向于结合circRNA分子。这也说明NF90/NF110倾向于结合有高级结构的RNA分子。

图9 NF90/NF110倾向于结合有高级结构的RNA分子（来自[1]）

过表达的circRNA可竞争性结合NF90/NF110

        基于上述的体外实验得知，NF90/NF110结合富含高级结构的RNA分子是序列非依赖的，过表达circRNA会不会直接把结合在病毒mRNA上的NF90分子竞争结合过来呢？于是作者构建了过表达circRNA的实验体系，结果表明过表达circPOLR2A或者circ-mCherry都可以竞争性结合原本结合在病毒mRNA上的NF90分子。

图10过表达的circRNA可竞争性结合NF90/NF110（来自[1]）

        本文的在线发表引起了国内外学术界不小的轰动，不仅大大推进了circRNA形成机制的认识，还增进了对病毒感染后细胞防御机制的认识。本文的结果还暗示了circRNA结合蛋白的可能性以及存在高级结构的可能性。这些都将称为下一步circRNA研究的重点方向。

参考文献：

1. Li, X., et al., Coordinated circRNA Biogenesis and Function with NF90/NF110 in Viral Infection. Mol Cell, 2017.

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